故事发生在第1集结束2年后，彼得·帕克继续过着自己的双重生活，平时是性情温和的大学生，晚上则化身为拥有超能力的英雄蜘蛛侠，可是这两者之间的微妙平衡却越来越难以维系，爱人、朋友和慈爱的阿姨都开始怀疑他的真实身份；同时他还多了个更可怕的敌人——章鱼博士(阿尔弗莱德·莫利纳)，彼得·帕克必须用尽全力对付这位邪恶魔头的疯狂计划。